學習啦 > 論文大全 > 技術論文 > 關于pcr技術論文

關于pcr技術論文

時間: 家文952 分享

關于pcr技術論文

  PCR技術是一種體外酶促合成、擴增特定DNA片段的方法。下面是學習啦小編整理的關于pcr技術論文,希望你能從中得到感悟!

  關于pcr技術論文篇一

  技術的研究進展

  摘要 PCR技術是一種體外酶促合成、擴增特定DNA片段的方法。因其高強的特異性和靈敏度以及檢測速度快、準確性好等優(yōu)點,已被廣泛地應用于水產、微生物檢測等許多領域。該文從PCR技術的原理及應用方面進行了綜述,并對其發(fā)展做出了展望。

  關鍵詞 PCR技術;研究進展;應用

  中圖分類號 Q819 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739(2012)10-0047-02

  PCR(polymerase chain reaction,PCR)即聚合酶鏈式反應,它是一種體外酶促合成,擴增特定DNA片段的方法。1985年,美國Karray等學者首創(chuàng)了PCR技術,并由美國Cetus公司開發(fā)研制[1]。隨著科學技術的發(fā)展和突破,PCR技術已在多個領域得到廣泛地應用,如微生物檢測、獸醫(yī)學、水產養(yǎng)殖等方面。由于該技術具有較強的靈敏度、準確度和特異性,又能快速進行檢測,因而其應用領域也在不斷延伸[2-3]。隨著PCR技術的不斷發(fā)展,在常規(guī)PCR技術的基礎上又衍生出了許多技術,如多重PCR(mutiplex PCR)技術[4]、實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,F(xiàn)Q-PCR)技術[5]、單分子PCR技術[6]。

  1 PCR技術原理

  PCR技術是根據(jù)待擴增的已知DNA片段序列、人工合成與該DNA 2條鏈末端互補的2段寡核苷酸引物,在體外將待檢DNA序列(模板)在酶促作用下進行擴增。PCR的整個技術過程經若干個循環(huán)組成,一個循環(huán)包括連續(xù)的3個步驟:第1步是高溫條件下的DNA模板變性,即模板DNA在93~94 ℃的條件下變性解鏈;第2步是退火,即人工合成的2個寡核苷酸引物與模板DNA鏈3’端經降溫至55 ℃退火;第3步是延伸,即在4種dNTP底物同時存在的情況下,借助TaqDNA聚合酶的作用,引物鏈將沿著5’-3’方向延伸與模板互補的新鏈[7]。經過這個循環(huán)后,合成了新鏈,可將其作為DNA模板繼續(xù)反應,由此循環(huán)進行。循環(huán)進程中,擴增產物的量以指數(shù)級方式增加,一般單一拷貝的基因循環(huán)25~30次,DNA可擴增l00萬~200萬倍[1]。PCR反應的步驟很簡單,但是具體的操作是復雜的,如退火溫度的確定、延伸時間的長短以及循環(huán)數(shù)等。因此,不同的反應體系應該確定適當?shù)姆磻獥l件,以避免假陰性或假陽性等情況的產生。

  2 PCR技術的分類

  在傳統(tǒng)PCR技術的基礎上,根據(jù)人們的需要以及各個領域的應用要求,又衍生出很多種類的PCR技術。新技術在各領域廣泛應用并逐漸改進,為進一步的研究提供了基礎。

  2.1 實時熒光定量PCR技術

  1996年,學者經過研究,在傳統(tǒng)PCR技術的基礎上,首創(chuàng)了實時熒光定量PCR技術,新技術已經應用至醫(yī)學領域、分子生物學和其他基礎研究領域。實時熒光定量PCR技術基于傳統(tǒng)技術的優(yōu)勢,還具有實時性、準確性、無污染,實現(xiàn)了自動化操作和多重反應,是PCR技術研究史上從定性到定量的飛躍[8]。

  熒光定量PCR技術最大的特點是能將熒光基團加入到PCR反應體系中,借助于熒光信號,累積實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析[9]。實時監(jiān)測這一特點是常規(guī)PCR技術所不具有的,因為其對擴增反應不能進行隨時的檢測。常規(guī)PCR技術的擴增終產物需要在凝膠電泳等條件下才能進行,無法對起始模板進行準確的定量,而熒光定量PCR技術的反應進程可以根據(jù)熒光信號的變化做出準確的判斷[10-11]。一個PCR循環(huán)反應結束之后,定量PCR儀可以收集1個熒光強度信號,熒光信號強度的變化可以反映產物量的變化情況,這樣就可以得到1條熒光擴增曲線[12]。熒光信號在指數(shù)擴增階段,PCR產物熒光信號的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性對應關系,然后進行定量分析[13]。

  2.2 多重PCR技術

  多重PCR(mutiplex PCR)技術是PCR技術的一種,為同一管中加入多對特異性引物,與PCR管內的多個模板反應,在一個PCR管中同時檢測多個目標DNA分子。多重PCR技術可以擴增一個物種的一個片段,也可以同時擴增多個物種的不同片段[14]。

  在同一反應體系中,多重PCR技術進行多個位點的特異性擴增時,引物間的配對、引物間的競爭性擴增等會對擴增效果產生重要影響。一方面,如果能選擇適宜的反應體系和反應條件,可極大地提高多重PCR的擴增效果[15]。主要包括退火溫度、退火及延伸時間、PCR緩沖液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面,DNA的抽提質量也影響多重PCR擴增效率,如DNA抽提不干凈或降解都將影響PCR擴增效果[16]。

  2.3 單分子PCR技術(SM-PCR)

  單分子PCR技術是在傳統(tǒng)PCR技術的基礎上發(fā)展的,基本循環(huán)過程相同,但在反應條件、模板數(shù)量、DNA 聚合酶選擇、引物設計方面具有不同點。該技術是以少量或單個DNA分子為模板進行的PCR[17]。

  單分子PCR技術反應中,DNA 模板濃度極低,這就要求模板有較高的質量。因為這是試驗成敗的決定性因素。在設計引物時,應該嚴格控制GC的含量和Tm值,同時盡量避免引物間存在可配對序列。在反應混合物模板數(shù)極低的情況下,若引物之間存在少量配對序列,擴增時極易形成二聚體,使反應無法進行,得不到所需要的產物[18]。由于單分子PCR技術反應的變性溫度(96~98 ℃)大多比常規(guī)PCR技術(94 ℃)略高,因而對DNA 聚合酶熱穩(wěn)定性的要求也更加嚴格,需要有較好的熱穩(wěn)定性,以防止溫度過高而使其失活。其變性時間(5~15 s)、退火時間及延伸時間也短于常規(guī)PCR技術[17]。

  3 PCR技術的應用

  3.1 PCR技術在水產上的應用

  基因表達是檢測某個基因在不同發(fā)育期或不同組織中的表達量變化,或受到某種試驗處理過程中的影響而出現(xiàn)表達量變化的情況。有學者應用real-time PCR技術研究碳水化合物含量對翹嘴紅鲴糖代謝酶G6Pase、GK以及PEPCK表達量的影響[19-21],研究結果可為翹嘴紅鲴飼料配方中的最合適糖含量提供理論依據(jù)。孫淑娜等[22]研究葉酸拮抗劑對斑馬魚心臟發(fā)育相關基因BMP2b及HAS2表達的影響,表明葉酸拮抗劑對早期胚胎的心臟發(fā)育影響較大,可導致斑馬魚心臟發(fā)育延遲及心臟形態(tài)異常,并下調斑馬魚心臟發(fā)育相關基因BMP2b及HAS2的表達,這可能是葉酸生物學活性受抑后導致心臟發(fā)育異常的機制之一。Sawyer et al[23]以斑馬魚的未受精卵、胚胎、仔魚和成魚為研究材料,采用實時熒光定量PCR技術,檢測了P450aromA和P450aromB在不同組織的表達量,表明在各組織中均有2種基因的表達,但表達量顯著不同,呈現(xiàn)組織特異性。

  3.2 PCR技術在微生物檢測上的應用

  1990年,Bej et al[24]在利用多重PCR的方法檢測了Leg-ionella類菌種和大腸類細菌,其結果是通過點對點方法固定的多聚dT尾捕捉探針和生物素標記的擴增DNA進行雜交來檢測的。張志東等檢測口蹄疫病毒(FMDV)持續(xù)性感染的帶毒動物,表明實時熒光定量PCR技術具有快速檢測、準確、客觀等優(yōu)勢,較優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]對PCR-ELISA的方法進行了評價,結果顯示,樣品中沙門氏菌的檢出率可以達到98%。

  4 展望

  傳統(tǒng)PCR技術以及衍生出來的新型PCR技術自面世以來,已被廣泛應用到生命科學的各個領域。隨著技術方法的不斷改進與完善,熒光定量PCR技術將會逐漸完善并廣泛應用。多重PCR技術在食品病原微生物、非致病微生物及環(huán)境微生物檢測中具有重要作用;未來的研究主要集中在去除食品抑制因子干擾、改進樣品前處理技術等方面,其次是整合應用多重PCR與其他技術,必將在未來食品微生物檢測中有非常好的應用前景。

  5 參考文獻

  [1] 常世敏.PCR在食品微生物檢測中的應用[J].邯鄲農業(yè)高等??茖W校學報,2004,21(4):23-25.

  [2] 唐永凱,俞菊華,徐跑,等.實時熒光定量PCR技術及其在水產上的應用[J].中國農學通報,2010(21):422-426.

  [3] 吳學貴.LPS刺激點帶石斑魚免疫相關基因的克隆與組織表達差異性分析[D].??冢汉D洗髮W,2011.

  [4] 侯立華,黃新,朱水芳,等.雙色熒光多重PCR技術及在禽流感病毒檢測中的應用[J].生物技術通報,2010(1):168-172.

  [5] 查錫良.生物化學[M].7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:483-485.

  [6] 張杰道.生物化學實驗技術PCR技術及應用[M].北京:科學出版社,2005:12-18.

  [7] 謝海燕.黑線倉鼠LHR部分序列克隆及組織器官的表達差異[D].曲阜:曲阜師范大學,2011.

  [8] KUBISTA M,ANDRADE J M,BENGTSSON M,et a1.The real-time pol-ymerase chain reaction[J].MoLecular Aspects of Medicine,2006,27(2-3):95-125.

  [9] AGINDOTAN B O,SHIEL P J,BERGER P H.Simultaneous detection of potato viruses,PLRV,PVA,PVX and PVY from dormant potato tubers by TaqMan real-timeRT-PCR[J].J Virol Methods,2007,142(1-2):l-9.

  [10] 李麗平.小麥慢銹品種葉片受條銹菌侵入后的木質素合成及調控研究[D].雅安:四川農業(yè)大學,2009.

  [11] 薛霜,獨軍政,高閃電,等.實時熒光定量PCR技術研究進展及其在獸醫(yī)學中的應用[J].中國農學通報,2010(7):11-15.

  [12] SCHUBERT J,F(xiàn)OMITCHEVA V,SZTANGRET-WISNIEWSKA J. Dif-ferentiation of Potato virus Y strains using improvedsets of diagnostic-PCR-primers [J].J Virol Methods,2007,140(1-2):66-74.

  [13] 袁繼紅.實時熒光定量PCR技術的實驗研究[J].現(xiàn)代農業(yè)科技,2010(13):20-22.

  [14] 朱善元.生物檢測技術PCR及其在獸醫(yī)微生物檢測中的應用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),1999(11):21-22.

  [15] 黃銀花,胡曉湘,李寧,等.影響多重PCR擴增效果的因素[J].遺傳,2003,25(1):65-68.

  [16] 陳諾,唐善虎,岑璐伽,等.多重PCR技術在食品微生物檢測中的應用進展[J].生物技術,2010,37(10):72-75.

  [17] 劉連生.常規(guī)PCR技術與單分子PCR技術[J].醫(yī)學信息,2010,23(11):4379-4380.

  [18] 顧超穎.汗孔角化病的臨床分析,SSH1、ARPC3基因突變檢測和表達譜分析[D].上海:復旦大學,2008.

  [19] 唐永凱,俞菊華,劉波,等.翹嘴紅鲌肝臟G6Pase催化亞基的克隆以及攝食和飼料中碳水化合物對其表達的影響[J].水產學報,2007,31(1):45-53.

  [20] 劉波,謝駿,蘇永騰,等.高碳水化合物日糧對翹嘴紅鲌生長、GK及GK mRNA表達的影響[J].水生生物學報,2008,32(1):47-53.

  [21] 俞菊華,戈賢平,唐永凱,等.碳水化合物、脂肪對翹嘴紅鲌PEPCK基因表達的影響[J].水產學報,2007,31(3):369-373.

  [22] 孫淑娜,桂永浩,宋后燕,等.葉酸拮抗劑甲氨喋呤導致斑馬魚心臟發(fā)育異常及BMP2bHAS2表達下調[J].中國當代兒科雜志,2007,9(2):159-163.

  [23] SAWYER S J,GERSTNER K A,CALLARD G.Real-time PCR analysis of cytochrome P450 aromatase expression in zebrafish:gene specific tissue disyribution,sex differences,developmental programming,and estrogen regulation[J].General and comparative endocrinology,2006,147(2):108-117.

  [24] BEJ A K,MAHBUBANI M H,MILLER R,et a1.Multiplex PCR amplif-ication and immobilized capture probes for detection of bacterial patho-gens and indicators in water[J].Mol Cell Probes,1990,4(5):353-365.

  [25] ZHANG Z D,ALEXANDERSEN S.Detection of carrier cattle and sheep persistently infected with foot-and-mouth disease virus by a rapid real-time RT-PCR assay[J].Journal of Virological Methods,2003,111(2):95-100.

  [26] ZHANG Z D,BASHIRUDDIN J B.Quantitative analysis of foot-and-mouth disease virus RNA duration in tissues of experimentally infected pigs[J].TheVeterinary Journal,2009,180(1):130-132.

  [27] METZGER-BODDIEN C,BOSTEL A,KEHLE J.Salmonella sp.PCR-ELISA for analysis of food samples[J].J Food Prot,2004,67(8):1585-1590.

點擊下頁還有更多>>>關于pcr技術論文

2439583